1984年，王祖贤在台主演了电影处女作《今年的湖畔会很冷》，该片入围了当年金马奖，之后她签约香港邵氏电影公司并放弃了在国光艺校的学业。

1987年，与张国荣合作，在由徐克、程小东打造的《倩女幽魂Ⅰ：妖魔道》中饰演女鬼聂小倩，令人印象深刻。同时她凭借这一角色提名香港电影金像奖最佳女主角。

1989年与周润发、刘德华合作出演由王晶执导的喜剧电影《赌神》。

1991年，与梁朝伟、张学友合作再次出演《倩女幽魂》第三部“道道道”，在片中饰演女鬼小卓，并凭借该片获得第25届西班牙锡切斯奇幻电影节最佳女主角。

1993年出演刘镇伟导演的喜剧电影《射雕英雄传之东成西就》。

1993年，出演笑傲江湖系列电影第三部——《东方不败风云再起》。片中饰演由林青霞扮演的东方不败的侍妾雪千寻，影片中王祖贤有大量反串男装。

1993年，再次与徐克导演合作，在《青蛇》中饰演白素贞。

1994年，出演由王家卫执导，《东成西就》原班人马组成的电影《东邪西毒》，该片获得第一届香港电影评论学会大奖最佳影片、第51届威尼斯国际影展最佳摄影等奖项。

2001年，王祖贤主演电影《游园惊梦》，该片当年被美国《时代》杂志评为十大电影之一。片中王祖贤有双重反串的戏份——女扮男装饰演《牡丹亭》中的多情公子柳梦梅，和现实中有几分男儿气概的民国女教师荣兰。这是她暌违影坛七年后首次主演电影。

2003年，主演内地电影《美丽上海》，这是王祖贤电影生涯的告别之作。